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細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一?，F(xiàn)在我們就來(lái)講講如何正確的凍存細(xì)胞：

一、材料

（一）儀器 　　1. 凈化工作臺(tái) 　　2. 離心機(jī) 　　3. 恒溫水浴箱 　　4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃） 　　5. 倒置相差顯微鏡 　　6. 培養(yǎng)箱 　　7. 液氮冰箱

（二）玻璃器皿 　　1. 吸管（彎頭、直頭） 　　2. 培養(yǎng)瓶 　　3. 玻璃瓶（250ml、100ml） 　　4. 廢液缸

（三）塑料器皿 　　1. 吸頭 　　2. 槍頭 　　3. 膠塞 　　4. 移液管（10ml） 　　5. 15ml離心管 　　6. 凍存管（1～2ml）

（四）其他物品 　　1. 微量加樣槍 　　2. 紅血球計(jì)數(shù)板 　　3. 記號(hào)筆 　　4. 醫(yī)用橡皮膏 　　5. 移液槍

（五）試劑 　　1. D-Hanks液 　　2. 小牛血清 　　3. 培養(yǎng)液 　　4. 雙抗（青霉素、鏈霉素） 　　5. 胰蛋白酶（0.08%） 　　6. 1NHCl 　　7. 7.4%NaHCO3 　　8. DMSO（分析純）或無(wú)色新鮮甘油
二、操作步驟

（一）細(xì)胞凍存 

1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液；

2. 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰蛋白酶把單層生長(zhǎng)的細(xì)胞消化下來(lái)，懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞則直接將細(xì)胞移至15ml離心管中、；

3. 離心1000rpm，5min；

4. 去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的zui終密度為5×106/ml～1×107/ml；

5. 將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml；

6. 在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時(shí)間及操作者；

7. 凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1～-2℃/ min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，可增至-5℃～-10℃/ 　　min；到-100℃時(shí)，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中**，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。

（二） 細(xì)胞復(fù)蘇

1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化。

2. 從37℃水浴中取出凍存管，打開(kāi)蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻；

3. 離心， 1000rpm，5min；

4. 棄去上清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；

5. 次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

三、注意事項(xiàng)

1．從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存，但為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。在凍存前一天換一次培養(yǎng)液； 　　

2．將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí)，要做好防護(hù)工作，以免凍傷； 　　

3．凍存和復(fù)蘇用新配制的培養(yǎng)液。