（一）檢測(cè)雜交的蛋白
這項(xiàng)試驗(yàn)zui后的步驟是檢測(cè)能夠特異性地和已經(jīng)固定在膜上的樣品蛋白發(fā)生相互作用的探針蛋白。為了得到的結(jié)果，我們應(yīng)該盡可能的取得信/噪比zui大的結(jié)果，也就是說(shuō)，我們需要在得到盡可能強(qiáng)的結(jié)果的同時(shí)盡可能避免背景的產(chǎn)生。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，非特異性背景結(jié)果的顯現(xiàn)和曝光時(shí)間是成線型關(guān)系的。ELISA試劑盒
具體步驟：
1.將印跡有蛋白的硝酸纖維素膜加上增強(qiáng)化學(xué)熒光顯影劑，孵育60s。
2.將過量的增強(qiáng)化學(xué)熒光顯影劑從膜上吸去，并將硝酸纖維素膜鋪放于清潔塑料膜上（比如保鮮膜）。
3.將塑料膜平整放入自顯影片盒中。
4.進(jìn)入暗室，將一張底片放于放射自顯影片盒中與印跡膜及塑料膜疊放后蓋上片盒。
5.根據(jù)*次結(jié)果信號(hào)的強(qiáng)弱調(diào)整壓片曝光的時(shí)間，一般為5--20s。ELISA試劑盒
6.在標(biāo)準(zhǔn)的洗片機(jī)中沖洗膠片。
出于安全的考慮，很多時(shí)候研究人員也會(huì)采用抗GST的抗體來(lái)檢測(cè)探針是否能發(fā)生與待測(cè)蛋白的相互作用。但是由于容易發(fā)生假陽(yáng)性，所以必須在蛋白印跡的清洗步驟中反復(fù)摸索出合適的條件。在zui后顯色時(shí)，也要爭(zhēng)取的信/噪比。
（二）膜結(jié)合蛋白的再折疊（選用）
由于被印跡到膜上的蛋白質(zhì)經(jīng)過了很多步驟，往往自身已經(jīng)失去了自然狀況下的構(gòu)象，或者在其被原核表達(dá)的過程中，得到的蛋白就已經(jīng)是以錯(cuò)誤的折疊方式存在。這種情況下會(huì)出現(xiàn)我們所不愿意看到的假陰性結(jié)果。為了zui大可能的避免這種假陰性，在沒有出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的時(shí)候，有時(shí)候我們需要采用再折疊的方法對(duì)膜結(jié)合蛋白進(jìn)行處理。
具體步驟：
1.在蛋白轉(zhuǎn)膜以后用50ml的變性緩沖液在4℃輕輕震蕩清洗有蛋白印跡的膜10min。注意，變性緩沖液要*覆蓋到膜的各個(gè)部位。
2.從容器中去除25ml變性緩沖液，按照1∶1比例加入堿性緩沖液進(jìn)行稀釋，再將膜放入后4度輕輕震蕩洗滌帶有蛋白印跡的膜10min。
3.重復(fù)以上步驟4遍。ELISA試劑盒
4.進(jìn)入上述雜交的程序，視結(jié)果而決定是否還需要進(jìn)一步的重復(fù)本步驟。
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